اویسٹر مشروم لیکس NRC 620 کی پیداوار اور بائیو کیمیکل خصوصیات اور سیب کے رس کی وضاحت میں اس کی کارکردگی کا جائزہ۔

28 ڈگری سینٹی گریڈ پر 25 دنوں کے جامد انکیوبیشن کے بعد، *Pleurotus ostreatus* NRC620 سے laccase نے فنگل کلچر میڈیم میں سب سے زیادہ سرگرمی دکھائی۔ اس انزائم کے لیے بہترین پی ایچ اور درجہ حرارت کی قدریں بالترتیب 3.0 اور 70 ° C تھیں۔ 40 ° C اور 50 ° C پر 2 گھنٹے انکیوبیشن کے بعد، انزائم کی سرگرمی بالترتیب 68.33% اور 59.61% برقرار رہی۔ سائٹریٹ فاسفیٹ بفر (پی ایچ 7.0) میں انکیوبیشن کے 2 گھنٹے بعد، انزائم کی سرگرمی 100٪ پر برقرار رہی۔ 10 mM MgSO₄ اور CuSO₄ کے اضافے سے انزائم کی سرگرمی میں بالترتیب تقریباً 21% اور 35% اضافہ ہوا، جبکہ NaCl، MnCl₂، KCl، اور CaCl₂ نے انزائم کی سرگرمی کو روک دیا۔ ABTS کو بطور ذیلی استعمال کرتے ہوئے، *Pleurotus ostreatus* NRC 620 laccase کے حرکیاتی پیرامیٹرز (Km اور Vmax) بالترتیب 1.99 mM اور 16,217 μmol min−1 L−1 تھے۔ سیب کے رس کے نمونوں کے انزیمیٹک علاج نے پی ایچ اور واسکاسیٹی دونوں کو نمایاں طور پر کم کیا، اور یہ کمی اسٹوریج کے وقت میں اضافے کے ساتھ منسلک ہے۔ Laccase کے علاج کے نتیجے میں سیب کے رس کے کل فینولک مواد میں معمولی کمی واقع ہوئی، لیکن اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں کوئی کمی نہیں دیکھی گئی۔
حالیہ برسوں میں، محققین نے کھانے کی صنعت میں سبز بایو ٹیکنالوجی کے اطلاق پر توجہ مرکوز کی ہے۔ لاکیس فوڈ انڈسٹری میں سب سے زیادہ مفید انزائمز میں سے ایک ہے جو جوس پروسیسنگ، بیکنگ، وائن اسٹیبلائزیشن، اور فوڈ پروڈکٹس کی آرگنولیپٹک خصوصیات کو بہتر بنانے جیسے شعبوں میں ایپلی کیشنز تلاش کرتا ہے۔¹بہت سے اونچے پودے اور سوکشمجیووں سے لیکیز خارج ہوتی ہے،²اور پھپھوندی جیسے ڈیوٹیرومائسیٹس، ایسکومائسیٹس، اور بیسیڈیومائسیٹس بھی لیکاس پیدا کر سکتے ہیں۔³Laccase (EC 1.10.3.2) ایک نیلے رنگ کا آکسیڈیس ہے جو تین مختلف تانبے کے ایٹموں پر مشتمل نظام کا استعمال کرتے ہوئے سالماتی آکسیجن کو پانی میں کم کرتا ہے، اس طرح مختلف فینولک مرکبات اور خوشبودار امائنز کو آکسائڈائز کرتا ہے۔ پھلوں اور سبزیوں کے جوس کی تیاری کے دوران، انزیمیٹک اور نان اینزیمیٹک براؤننگ اہم مسائل ہیں۔⁴چونکہ یہ مادے رس کے رنگ، ذائقہ اور خوشبو پر منفی اثر ڈالتے ہیں، اس لیے انہیں ہٹا دینا چاہیے۔⁵
تمام پھلوں میں، سیب دنیا بھر میں اور یورپی یونین میں سب سے زیادہ کھائے جاتے ہیں۔ 2019 میں، سیب کی پیداوار 87 ملین ٹن سے تجاوز کر کے عالمی سطح پر تیسرے نمبر پر رہی۔⁶سیب میں متعدد فینولک مرکبات ہوتے ہیں، جن میں فلیوونائڈز اور فینولک ایسڈ جیسے کیفیک ایسڈ اور کلوروجینک ایسڈ شامل ہیں۔⁷چونکہ سیب کا رس عام طور پر اس کی واضح شکل میں کھایا جاتا ہے، تقریباً 50% سے 90% فینولک اجزاء فلٹریشن کے عمل کے دوران ضائع ہو جاتے ہیں۔⁸آج، صارفین کم سے کم پروسیس شدہ مصنوعات کا انتخاب کرتے ہیں، جیسے کہ ابر آلود سیب کا جوس جس میں پولیفینول کی مقدار زیادہ ہے۔ تاہم، اس کے اعلی فینولک مواد کی وجہ سے، اس قسم کے سیب کا رس خاص طور پر رنگت اور سیاہ ہونے کے لیے حساس ہے۔⁹مختلف ٹیکنالوجیز، بشمول گرمی کے علاج کے طریقے جیسے کہ 60-90 ° C پر پاسچرائزیشن، سیب کے رس کو کم کرنے یا سیاہ ہونے کو روکنے کے لیے استعمال کی جاتی ہیں۔¹⁰تاہم، Sauceda-Gálvez کی تحقیق کے مطابق¹¹تھرمل پروسیسنگ غیر مستحکم کیمیکلز کو تباہ کر سکتی ہے اور سیب کے رس کی آرگنولیپٹک خصوصیات کو متاثر کر سکتی ہے۔ تھرمل پروسیسنگ کے طریقوں کے متبادل میں سپر کریٹیکل کاربن ڈائی آکسائیڈ، الٹرا وائلٹ تابکاری، الٹراساؤنڈ، ہائی ہائیڈرو سٹیٹک پریشر، یا ہائی پریشر ہوموجنائزیشن شامل ہیں۔¹²ان ٹیکنالوجیز کی کارکردگی اور مناسب پھلوں کے رس کی پیداوار کا انحصار استعمال شدہ پیرامیٹرز اور مصنوعات کی خصوصیات پر ہے۔ ان کا وسیع پیمانے پر استعمال زیادہ لاگت، کچھ کھانے کی مصنوعات کے معیار پر منفی اثرات، یا ناکافی انزائم کے غیر فعال ہونے سے محدود ہے۔^13,14
پھلوں کے رس کو مستحکم کرنے اور واضح کرنے کے لیے Laccase کا استعمال کیا جا سکتا ہے۔¹⁵Gökmen et al.¹⁶پھلوں کے جوس کی وضاحت کے لیے لاکیز کے استعمال کی سفارش کریں کیونکہ یہ فینولک مرکبات کو مؤثر طریقے سے پولیمر یا اولیگومر میں تبدیل کرکے ہٹاتا ہے جو کسی بھی الٹرا فلٹریشن جھلی کے ذریعے آسانی سے ہٹا دیے جاتے ہیں، جس سے سیب کا جوس 50 ڈگری سینٹی گریڈ پر چھ ہفتوں تک مستحکم رنگ اور وضاحت برقرار رکھتا ہے۔ پیوریفائیڈ *ٹرائکوڈرما* لیکیس کو ایلومینا موتیوں پر متحرک کیا گیا تھا اور اسے سیب کے جوس کی مائکروبیل آلودگی کی وجہ سے غیر ذائقہ والے مرکبات کو منتخب طور پر ہٹانے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔¹⁷
سیب کے جوس کے تقریباً 80-90% غیر مستحکم اجزاء ایسٹرس اور الڈیہائیڈز ہوتے ہیں، جو رس کو منفرد مہک دیتے ہیں۔¹⁸*Trametes versicolor* سے Laccase کو سیب کے رس کی وضاحت کے لیے ناریل کے نوجوان چھلکوں سے قدرتی فائبر سے بنا سستی مدد پر متحرک کیا گیا تھا۔¹⁹پچھلے مطالعات میں سیب کے رس (رنگ اور گندگی) کے استحکام کی تحقیقات کی گئی ہیں انزائم فری یا متحرک طریقوں کا استعمال کرتے ہوئے، یا الٹرا فلٹریشن کے ساتھ۔^5,19تاہم، سٹوریج کے دوران سیب کے جوس کی فزیکو کیمیکل خصوصیات پر فنگل لیکیسیس کا اثر واضح نہیں ہے۔ لہذا، اس مطالعے کا مقصد فزیوکیمیکل خصوصیات، فینولک مرکب مواد، اور سیب کے جوس کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں پھپھوندی کی کمی کے علاج کے بعد تجرباتی طور پر چھان بین کرنا تھا اور دو ہفتے کے ریفریجریٹڈ اسٹوریج۔ لیکیسس میں فینولک مرکبات کو آکسائڈائز کرنے کی صلاحیت ہوتی ہے، جس کی وجہ سے وہ مختلف صنعتی عملوں میں استعمال کے لیے امید افزا ہوتے ہیں، بشمول رس کی وضاحت۔ اس مطالعہ نے *Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے خامیوں کی جانچ کی، جوس کی وضاحت میں ان کی سرگرمی اور تاثیر کے لیے مثالی حالات پر توجہ مرکوز کی۔ اگرچہ اویسٹر مشروم (P. ostreatus NRC 620) پر تحقیق ابھی تک محدود ہے، پچھلے مطالعات میں مختلف فنگل ذرائع، جیسے Trametes versicolor اور Ganoderma lucidum کے خامروں کی جانچ کی گئی ہے۔ اس مطالعے کا مقصد خوراک کی صنعت میں اس انزائم کے ممکنہ استعمال کا جائزہ لینا اور اس کی منفرد خصوصیات کو نمایاں کرنا تھا، خاص طور پر اس کے مثالی پی ایچ اور درجہ حرارت۔
2,2′-Azooxybis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) سگما-الڈرچ (کینیڈا) سے خریدا گیا تھا۔ دیگر تمام ری ایجنٹس تجزیاتی درجہ کے تھے۔
نیشنل ریسرچ سنٹر کے مائکروبیل کلچر کلیکشن سنٹر نے معروف اویسٹر مشروم سٹرین NRC620 حاصل کیا۔ ذیلی ثقافت کے بعد، اس تناؤ کو آلو کے ڈیکسٹروز ایگر سلینٹ پر 4 ڈگری سینٹی گریڈ پر ذخیرہ کیا جاتا تھا۔ انوکولم کی تیاری کا طریقہ درج ذیل تھا: 10 دن پرانا، مکمل طور پر تیار شدہ مائسیلیم کو آلو ڈیکسٹروز ایگر پلیٹوں پر ٹیکہ لگایا گیا اور 28 ڈگری سینٹی گریڈ پر انکیوبیٹ کیا گیا۔ 10 دن کے بعد، جراثیم سے پاک دھاتی پنچ کا استعمال کرتے ہوئے آگر میڈیا سے 12-ملی میٹر قطر کے تین مائسییل بلاکس کو ہٹا دیا گیا اور 250-mL Erlenmeyer فلاسکس میں رکھ دیا گیا جس میں 50 mL جراثیم سے پاک کلچر میڈیم (pH 5.0، جیسا کہ پہلے عثمان ایٹ ال نے بیان کیا ہے۔²⁰)۔ ثقافتوں کو 18 دن کے لئے 28 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ اس کے بعد ثقافتوں کو واٹ مین نمبر 1 فلٹر پیپر کے ذریعے فلٹر کیا گیا، اور اس کے نتیجے میں سپرنیٹنٹ نے انزائم کے ذریعہ کے طور پر کام کیا۔
Laccase سرگرمی کا تعین ABTS کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔ رد عمل کے مرکب (2 mL) میں 0.3 mM ABTS کا 500 μL (0.1 M سوڈیم سائٹریٹ بفر، pH 4.5 میں تحلیل کیا گیا) اور آست پانی سے گھلائے گئے انزائم نمونے کی مطلوبہ مقدار شامل تھی۔^21,22اس بات کو مدنظر رکھتے ہوئے کہ laccase کمرے کے درجہ حرارت (28 ° C ± 2) پر ABTS کو آکسائڈائز کر سکتا ہے، ABTS آکسیڈیشن کا تعین 420 nm (ε) پر جاذبیت میں اضافے کی پیمائش کرکے کیا گیا تھا۔₄₂₀= 36,000 سینٹی میٹر^-1 M ^-1) Agilent Carry-100 UV سپیکٹرو فوٹومیٹر کا استعمال کرتے ہوئے 1 μmol ABTS کو فی منٹ آکسائڈائز کرنے کے لیے laccase سرگرمی کے ایک یونٹ کی ضرورت تھی۔ پروٹین کے ارتکاز کا تعین بریڈ فورڈ کے طریقہ کار سے بوائین سیرم البومین کو اندرونی کنٹرول کے طور پر استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا۔^23,24
اویسٹر مشروم سٹرین NRC 620 سے انزائم حاصل کرنے کے بعد، اس کی سرگرمی کو 28 ڈگری سینٹی گریڈ پر جامد حالات میں 25 دنوں تک مختلف کاشت کے وقفوں پر ناپا گیا۔
لیکیس سرگرمی پر درجہ حرارت کے اثر کا مطالعہ کرنے کے لیے، 20 سے 90 ° C تک درجہ حرارت کی حد میں تجربات کیے گئے۔ انزائم کو شامل کرنے اور رد عمل شروع کرنے سے پہلے، بفر (0.1 M سوڈیم سائٹریٹ، pH 4.5) اور سبسٹریٹ (ABTS) کو مختلف درجہ حرارت پر 5 منٹ تک ملا کر انکیوبیٹ کیا گیا۔ انزائم تھرمل استحکام کا اندازہ 0.05 M سوڈیم فاسفیٹ بفر (pH 7.0) میں بالترتیب 2 گھنٹے کے لیے 40، 50، 60، اور 70 ° C پر انکیوبیشن کے ذریعے کیا گیا۔ اس کے بعد ABTS سبسٹریٹ کا استعمال کرتے ہوئے بقایا سرگرمی کا اندازہ کیا گیا۔
2.5 سے 7.0 کی پی ایچ رینج کے ساتھ 0.1 M سائٹریٹ فاسفیٹ بفرز میں ABTS کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے laccase سرگرمی پر pH کے اثر کا اندازہ لگایا گیا۔ پی ایچ کے استحکام کا اندازہ لگانے کے لیے انزائم محلول کو 0.1 M سائٹریٹ اور ٹریس بفرز (pH 3، 4، 6، اور 7) میں دو گھنٹے کے لیے 40 ° C پر انکیوبیٹ کیا گیا تھا۔ انکیوبیشن کے بعد سبسٹریٹ کے بطور ABTS کے ساتھ بقایا سرگرمی کا حساب لگایا گیا تھا۔
لکیس کو سوڈیم فاسفیٹ بفر (0.05 M، pH 7.0) میں 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں مختلف دھاتی آئنوں (Mg2+, Cu2+, Co2+, Ca2+, Zn2+, K+, Na+, اور Mn2+) بالترتیب 2.5 mM اور 10 کی تعداد میں تھے۔ اس کے بعد سبسٹریٹ (ABTS) کو رد عمل شروع کرنے کے لیے شامل کیا گیا، اور متعلقہ سرگرمی کا اندازہ لگایا گیا۔
متحرک پیرامیٹرز (Vmax اور Km) کا تعین کرنے کے لیے مختلف ارتکاز (0.025–3 mM) میں ABTS آکسیڈیشن کو pH 4.5 پر ناپا گیا۔ حرکی^مستقلMichaelis-Menten کی مساوات کا حساب ایک Lineweaver-Burk پلاٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا، جو رد عمل کی شرح کو سبسٹریٹ ارتکاز کے فعل کے طور پر پیش کرتا ہے۔ گراف پیڈ پرزم ورژن 6.01 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے لائن ویور-برک پلاٹ سے حرکی مستقل کا حساب لگایا گیا۔
سیبوں کو نلکے کے پانی سے اچھی طرح دھونے کے بعد، انہیں آدھے حصے میں کاٹ کر مکمل طور پر خودکار Braun MP80 ایپل جوسر (جرمنی میں بنایا گیا) کا استعمال کرتے ہوئے جوس بنا لیا گیا۔ رس کو پنیر کی چار تہوں کے ذریعے فلٹر کیا گیا تھا۔ کنٹرول گروپ میں کوئی انزائمز شامل نہیں کیے گئے، جبکہ 2.0% laccase (سب سے زیادہ مؤثر ارتکاز کا تجربہ کیا گیا) تازہ تیار کردہ سیب کے جوس میں شامل کیا گیا، جسے پھر دو ہفتوں کے لیے 4°C پر محفوظ کیا گیا۔
ٹائٹریٹ ایبل تیزابیت (TA) اور pH کا تعین بولٹن ایٹ کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔^al.27. ہر نمونے کی pH کو ڈیجیٹل pH میٹر (JENWAY 3510 pH میٹر) کا استعمال کرتے ہوئے ماپا گیا۔ ٹائٹریٹ ایبل تیزابیت (TA) کا حساب درج ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے مالیک ایسڈ کی بنیاد پر کیا گیا تھا۔
جہاں V اور C بالترتیب ٹائٹریشن میں استعمال ہونے والے سوڈیم ہائیڈرو آکسائیڈ محلول کا حجم (mL) اور ارتکاز (0.1 mol/L) ہیں۔ K مالیک ایسڈ کی تبدیلی کا گتانک ہے، جو 0.067 کے برابر ہے، اور W سیب کے رس کا ماس (g) ہے۔
کل حل پذیر ٹھوس (^{ٹی ڈی ایس}) تمام رس کے نمونوں کے مواد کا تعین PAL-1 پاکٹ ریفریکٹومیٹر (ATAGO، Tokyo، Japan) کے ذریعے کیا گیا تھا۔ ہر پیمائش کے بعد، آپٹیکل لینس کو ڈیونائزڈ پانی سے دھویا گیا، اور ہر سیب کے رس کے نمونے کا تین بار ٹیسٹ کیا گیا۔ ہر نمونے کی قیمت کا حساب تین پیمائشوں کی اوسط سے کیا گیا تھا۔ ہر سیب کے رس کے نمونے کے لیے اوسط ± معیاری انحراف کا حساب بھی ان نتائج کی اوسط سے لگایا گیا تھا۔
سیب کے رس کے نمونوں کی viscoelasticity کا اندازہ گھومنے والے ویزکومیٹر (RV، Rheotest 2، Germany) کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا۔ نمونہ ویزکومیٹر کے "S2″ سلنڈر کے اندر رکھا گیا تھا۔ ظاہری viscosity کی نمائندگی قینچ کے دباؤ بمقابلہ قینچ کی شرح کی وکر کی ڈھلوان سے کی گئی تھی، جس کا حساب قینچ کے دباؤ اور متعلقہ منحنی خطوط سے مختلف قینچ کی شرحوں پر کیا گیا تھا (1.00 سے 437.4 تک)۔ مندرجہ ذیل کے طور پر:
جہاں η ظاہری viscosity (cP) ہے، τ قینچ کا تناؤ ہے (dyn/cm²)، γ ہے قینچ کی شرح (sec⁻¹)، اور (τ) مندرجہ ذیل فارمولے کا استعمال کرتے ہوئے ٹارک (α) اور سلنڈر (Z) اقدار کا استعمال کرتے ہوئے شمار کیا جاتا ہے: τ = Z ۔ α
براؤننگ انڈیکس کا تعین میڈاو ایٹ کے طریقہ کار کے مطابق کیا گیا تھا۔^al.29. ایک 10 ملی لیٹر جوس کا نمونہ 10 منٹ کے لئے 2750 xg پر سینٹرفیوج کیا گیا تھا۔ 5 ملی لیٹر جوس سپرنٹنٹ کو 5 ملی لیٹر 95 فیصد ایتھنول کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ شیمدزو یووی سپیکٹرو فوٹومیٹر (UV-1601 PC) کا استعمال کرتے ہوئے مرکب کی جاذبیت کو 420 nm پر ماپا گیا۔
کل فینولک مواد (ٹی پی سی) کا تعین رنگین طور پر فولین-سیوکالٹیو ری ایجنٹ کا استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تھا جیسا کہ بولٹن ایٹ ال نے بیان کیا ہے۔^[27] گیلک ایسڈ کا ایک معیاری وکر 0 سے 500 mg/L (^r²= 0.997)۔ نتائج گیلک ایسڈ کے مساوی (mg GAE/mL) کے طور پر ظاہر کیے جاتے ہیں۔
25 μL سیب کے رس میں 125 μL ڈسٹل واٹر اور 2850 μL FRAP محلول شامل کریں اور مکسچر کو اندھیرے میں چھوڑ دیں۔³⁰منٹ پھر Shimadzu UV سپیکٹرو فوٹومیٹر (UV-1601 PC) کا استعمال کرتے ہوئے 593 nm پر جاذبیت کی پیمائش کریں۔ FRAP ریجنٹ 300 mM ایسیٹیٹ بفر (pH 3.6)، 20 mM آئرن (III) کلورائیڈ، اور 10 mM 2,4,6-tris(2-pyridyl) triazine (TPTZ) (40 mM HCl میں تحلیل کیا گیا ہے) کو a:1rat10 میں ملا کر تیار کیا گیا تھا۔ ٹرالوکس کو بطور معیاری استعمال کرتے ہوئے ایک معیاری وکر تیار کیا گیا تھا (^R²= 0.999)، اور نتائج کو μM Trolox/mL کے طور پر ظاہر کیا جاتا ہے۔
علاج شدہ اور غیر علاج شدہ جوس کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین ڈی پی پی ایچ طریقہ استعمال کرتے ہوئے کیا گیا تاکہ ڈی پی پی ایچ فری ریڈیکلز کو ختم کرنے کی ان کی صلاحیت کا اندازہ کیا جاسکے۔³¹میتھانول میں دس مائکرو لیٹر جوس کو DPPH محلول (100 μM) کے 1 ملی لیٹر کے ساتھ ملایا گیا تھا۔ 30 منٹ تک اندھیرے میں رد عمل کے بعد، شیمادزو یووی سپیکٹرو فوٹومیٹر (UV-1601 PC) کا استعمال کرتے ہوئے مرکب کی جاذبیت کو 517 nm پر ماپا گیا۔ نتائج کا اظہار انشانکن وکر کی بنیاد پر ٹرولوکس مساوی (μM trolox/ml) کے طور پر کیا گیا تھا۔_^R2= 0.990)۔
حاصل کردہ اعداد و شمار سے پتہ چلتا ہے کہ این آر سی 620 اویسٹر مشروم میں ابال کے 18 ویں دن کے اختتام تک زیادہ سے زیادہ لیکیس کی پیداوار دیکھی گئی، جو کہ 1302 U/L کی سرگرمی تک پہنچ گئی۔ اس نے لکیس کی پیداوار کے لیے بہترین کاشت کے وقت کا تعین کرنے کی بنیاد کے طور پر کام کیا (شکل 1)۔ اگرچہ بڑھتی ہوئی کاشت کے وقت کے ساتھ انزائم کی پیداوار میں اضافہ ہوا، لیکن اضافے کی شرح براہ راست کاشت کے وقت کے متناسب نہیں تھی۔ 21 دن کے بعد، انزائم کی سرگرمی میں صرف 90 U/L (1390 U/L تک) اضافہ ہوا تھا۔ لہٰذا، 18 دنوں کو بالآخر کاشت کے زیادہ سے زیادہ وقت کے معاشی فوائد کے ساتھ مصنوعات کی پیداوار کو متوازن کرنے کے لیے منتخب کیا گیا۔
Pleurotus ostreatus NRC 620 میں لکیس کی پیداوار پر کاشت کے وقت کا اثر۔ تین (12 ملی میٹر) فنگل مائسییل بلاکس کو 50 ملی لیٹر جراثیم سے پاک میڈیم میں ٹیکہ لگایا گیا اور پھر مختلف اوقات میں 28 ° C پر کلچر کیا گیا۔
دیگر مطالعات سے مطابقت رکھتے ہوئے، ہمارے نتائج بتاتے ہیں کہ فنگی کے ذریعے چوٹی کی لکیسی سراو کو حاصل کرنے کے لیے مثالی کلچر کی مدت 7 سے 36 دن کے درمیان ہونے کا امکان ہے۔³²Ezike et al کے مطابق.³³, *Trametes polyzona* WRF03 نے خمیر کے نویں دن کے اختتام تک 1637 U/mg پروٹین کی ایک مخصوص سرگرمی کے ساتھ سب سے زیادہ مقدار میں laccase پیدا کی۔ مزید برآں، عثمان وغیرہ۔³⁴پتہ چلا کہ *Trichoderma harzianum* S7113 نے ثقافت کے پانچویں دن بڑی مقدار میں laccase کا اخراج کیا۔ چودہویں دن لاکاس کی پیداوار کی شرح ایک چوٹی کی سرگرمی تک پہنچ گئی اور پھر آہستہ آہستہ کم ہوتی گئی۔³⁴اگرچہ انزائم کی رطوبت اہم نشوونما کے مرحلے کے دوران بھی ہوسکتی ہے، لیکن یہ عام طور پر درمیانی مرحلے کے دوران عروج پر ہوتی ہے اور کاربن یا نائٹروجن کے ذریعہ کے استعمال سے شروع ہوتی ہے۔^34,35
اگرچہ Pleurotus ostreatus NRC 620 کے laccase نے 50 ° C سے 80 ° C تک وسیع درجہ حرارت کی حد میں اعلی سرگرمی کی نمائش کی، جو کہ عروج کی سرگرمی (69-98%) کے قریب ہے، اس کی زیادہ سے زیادہ سرگرمی 70 ° C (تصویر 2a) پر دیکھی گئی۔ درجہ حرارت کی اس حد سے باہر، انزائم کی سرگرمی تقریباً 70 ° C پر کم ہو گئی۔ یہ نتائج بتاتے ہیں کہ انزائم اعلی درجہ حرارت پر فعال ہے، ممکنہ طور پر کیونکہ اعلی درجہ حرارت رد عمل کی حرکی توانائی کو بڑھاتا ہے۔
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 میں laccase سرگرمی پر رد عمل کے درجہ حرارت (a) اور pH (b) کا اثر۔ 20 سے 90 ° C تک کا درجہ حرارت انزائم کو شامل کرنے اور رد عمل شروع کرنے سے پہلے 5 منٹ تک مختلف درجہ حرارت پر مرکب کو پہلے سے انکیوبیٹ کرکے حاصل کیا گیا تھا۔ 2.5 سے 7.0 کی پی ایچ رینج میں 0.1 M سائٹریٹ فاسفیٹ بفر پر مشتمل حل میں ABTS کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے laccase سرگرمی پر pH کے اثر کا اندازہ لگایا گیا۔
Ezike et کے مطابق^al.33, *Trametes polyzona* WRF03 laccase کے لیے بہترین درجہ حرارت 55 °C ہے، جو کہ *Ganoderma lucidum* کے لیے درجہ حرارت کے برابر ہے۔^laccase36اور *Trametes polyzona* KU-RNW02737 کے لیے بہترین درجہ حرارت (50 °C) کے برابر^کمی . ^{بالڈرین38}نوٹ کرتا ہے کہ، دوسرے لگنن کو کم کرنے والے انزائم سسٹم کی طرح، لیکیس کے لیے درجہ حرارت کی مثالی حد 50 اور 70 ° C کے درمیان ہے۔
نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ انزائم نے پی ایچ 3.0 پر سب سے زیادہ سرگرمی کا مظاہرہ کیا، پی ایچ 3.5 پر 94 فیصد سرگرمی تک پہنچ گئی۔ تاہم، یہ 2.5 سے 7.0 (شکل 2b) تک وسیع پی ایچ رینج میں فعال رہا۔ مزید برآں، اس نے غیر جانبدار یا الکلائن حالات کے مقابلے تیزابی حالات میں زیادہ سرگرمی کی نمائش کی۔ اس کی سرگرمی 2.5 سے 4.5 تک pH کی حد میں کم از کم 77% رہی، لیکن pH 7.0 پر صرف 38% تک پہنچ گئی۔ *Trametes polyzona* WRF03 سے laccase کے لیے بہترین pH 4.533 تھا، جو *Trametes polyzona* KU-RNW02737، *Trichoderma harzanium* 39، *Pleurotus* sp سے laccases کے لیے pH کے برابر ہے۔ 40، اور *Trametes hirsuta* 41. تاہم، Chairin et al کے مطالعہ کے مطابق۔⁴², *Polymorpha f سے laccase کے لیے بہترین pH۔ sp.* WR710-1 2.2 ہے، جبکہ *Polymorpha f سے laccase کے لیے بہترین pH۔ sp.* IBL-04 5.043 ہے۔ T2/T3 laccase کے تانبے کے ایٹموں کے ساتھ ہائیڈرو آکسائیڈ anions (laccase inhibitor) کا پابند ہونا غیر جانبدار یا alkaline pH حالات میں laccase کی سرگرمی میں کمی کی وجہ ہو سکتا ہے۔ یہ T1 مرکز سے T2/T3 مرکز تک اندرونی الیکٹران کی منتقلی میں خلل ڈال سکتا ہے۔^{محدود کرنا}انزائم کی سرگرمی 23,44
مختلف درجہ حرارت پر انزائم کو انکیوبیٹ کرنے سے پتہ چلا کہ انکیوبیشن کا وقت اور درجہ حرارت دونوں ہی انزائم کے استحکام کو متاثر کرتے ہیں۔ خاص طور پر، *Trametes polyzona* NRC 620 سے 40℃ اور 50℃ پر زیادہ استحکام کا مظاہرہ کیا، 120 منٹ کے بعد بالترتیب 68.33% اور 59.61% اپنی ابتدائی سرگرمی کو برقرار رکھا (شکل 3a)۔ اس کے برعکس، انہی حالات کے تحت (40℃ اور 50℃، 120 منٹ)، *Trametes polyzona* WRF03 سے laccase نے بالترتیب 64.38% اور 42.92% اپنی سرگرمی برقرار رکھی۔³³اس کے برعکس، انکیوبیشن کے وقت اور درجہ حرارت میں اضافہ سے *Trametes polyzona* NRC 620 laccase کے استحکام میں کمی آئی۔ 60 ℃ اور 70 ℃ پر 60 منٹ تک انکیوبیشن کے بعد، اس کی سرگرمی بالترتیب 39.24% اور 1.72% تک کم ہو گئی (شکل 3a)۔ تجرباتی نتائج سے مطابقت رکھتے ہوئے، *Trametes polyzona* WRF03 کے laccase نے تھرمل علاج کے پورے عمل میں 40 اور 50℃ پر زیادہ استحکام ظاہر کیا۔³³اسی طرح، Lueangjaroenkit et^al.37اور چیرین وغیرہ^al.42Trametes polyzona KURNW027 اور Trametes polyzona WR710-1 سے بالترتیب 1 گھنٹے کے لیے 50 °C پر laccases کے استحکام کی اطلاع دی۔ مختلف بائیوٹیکنالوجیکل شعبوں میں لاگو ہونے والے ایک مفید بایوکیٹیلیسٹ کے طور پر، لیکاس کو درجہ حرارت کی وسیع رینج میں اچھی استحکام اور کارکردگی ہونی چاہیے۔
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے laccase کا تھرموسٹیٹک استحکام (a) اور pH استحکام (b)۔ تھرموسٹیٹک استحکام کا اندازہ 0.05 M سوڈیم فاسفیٹ بفر (pH 7.0) میں 40, 50 ° C اور بالترتیب 50 ° C پر انزائم محلول کو انکیوبیٹ کرکے لگایا گیا۔ pH استحکام کا اندازہ 0.1 M سائٹریٹ بفر اور Tris بفر (pH 3, 4, 6, اور 7) میں انزائم سلوشن کو 40 ° C پر 2 گھنٹے کے لیے لگا کر لگایا گیا۔ انکیوبیشن کے بعد ABTS کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے ہوئے بقایا سرگرمی کا حساب لگایا گیا۔
انزائم کے استعمال اور ذخیرہ کرنے کے لیے بہترین حالات کا تعین کرنے کے لیے، ہم نے laccase کے استحکام پر pH کے اثر کی چھان بین کی۔ مختلف پی ایچ اقدار کی نمائش نے پروٹین کے ڈھانچے کے استحکام کو نمایاں طور پر متاثر کیا، اس طرح انزائم مالیکیول کے استحکام اور سرگرمی کو متاثر کیا۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ انزائم تیزابیت کے حالات میں کم مستحکم تھا، جبکہ اس نے اعلی پی ایچ اقدار (غیر جانبدار اور الکلین خطوں) میں بہتر استحکام کا مظاہرہ کیا۔ 7.0، 6.0، 4.0، اور 3.0 کی pH اقدار پر، 120 منٹ کے بعد انزائم برقرار رکھنے کی شرح بالترتیب تقریباً 100%، 62.54%، 52.39%، اور 11.14% تھی (تصویر 3b)۔ *Strombus multisus* WRF03 laccase نے غیر جانبدار pH اقدار (5.5–6.5) پر زیادہ استحکام اور تیزابی pH اقدار (4.0 سے نیچے) پر کم استحکام ظاہر کیا۔ 5.5، 6.0 اور 6.5 کی pH اقدار پر 120 منٹ کے بعد، انزائم برقرار رکھنے کی شرح بالترتیب تقریباً 82%، 100%، اور 93% تھی۔³³خیرین وغیرہ۔⁴²نوٹ کیا کہ Trametes polyzona WR710-1 سے laccase 6.0 سے 7.0 کی pH رینج میں مستحکم تھا، جبکہ Sayed et al.⁴⁵نے ظاہر کیا کہ غیر جانبدار پی ایچ حالات کے تحت لاکیس زیادہ مستحکم تھا۔ تاہم، سیرینا یونی کلر سے لیکیس نے بھی الکلین حالات (پی ایچ 9.0) میں استحکام کا مظاہرہ کیا۔⁴⁶. مطالعہ کیے گئے لکیسز نے وسیع پی ایچ رینج میں اعلی استحکام ظاہر کیا۔ یہ صنعتی ایپلی کیشنز کے لیے ایک اہم خصوصیت ہو سکتی ہے۔
چونکہ کچھ دھاتی آئنوں کے انزائم کی سرگرمی پر محرک اور روکنے والے اثرات ہوتے ہیں، اس لیے صنعتی استعمال میں خامروں کی سرگرمی پر ان کے اثرات پر غور کیا جانا چاہیے۔ یہ بہت اہم ہے کیونکہ دھاتی آئن عام ماحولیاتی آلودگی ہیں جو ایکسٹرا سیلولر انزائمز کے استحکام اور ترکیب کو متاثر کر سکتے ہیں۔⁴⁷*Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے laccase پر متعدد دھاتی آئنوں کے اثرات کی تحقیقات کے لیے، ہم نے اسی طرح کے تجربات کیے ہیں۔ جیسا کہ شکل 4 میں دکھایا گیا ہے، استعمال شدہ دھات کی قسم پر منحصر ہے، دھاتی آئن کے ارتکاز کو 2.5 mM سے 10 mM تک بڑھانا انزائم کے کام کو منفی طور پر متاثر کرتا ہے۔ مثال کے طور پر،^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺، اور^Cu²⁺ینجائم کی سرگرمی کو متحرک اور چالو کر سکتا ہے، جبکہ^نہیں , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺، اور^K⁺انزائم کی سرگرمی کو روک سکتا ہے۔ 10 ایم ایم کے ارتکاز میں، Cu²⁺ اور Mg²⁺ آئن *Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے لیکسیس سرگرمی کے سب سے زیادہ طاقتور ایکٹیویٹر تھے، جو بالترتیب تقریباً 34% اور 20% کی ایکٹیویشن ڈگری فراہم کرتے ہیں۔ تاہم، 10 ایم ایم کے ارتکاز میں، Ca²⁺ آئن لیکسیس کے سب سے زیادہ قوی روکنے والے تھے، جو انزائم کی سرگرمی کو تقریباً 60% تک کم کرتے تھے۔
Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase کی سرگرمی پر دھاتی آئنوں کا اثر۔ لیکاس کو سوڈیم فاسفیٹ بفر (0.05 ایم، پی ایچ 7.0) میں 10 منٹ تک انکیوبیٹ کیا گیا تھا جس میں 2.5 ایم ایم اور 10 ایم ایم کی تعداد میں مختلف دھاتی آئنوں پر مشتمل تھا۔ اس کے بعد ردعمل سبسٹریٹ (ABTS) کے اضافے سے شروع کیا گیا، جس کے بعد متعلقہ سرگرمی کی پیمائش کی گئی۔
ہمارے نتائج دوسرے مصنفین کے ساتھ مطابقت رکھتے ہیں جنہوں نے پایا کہ Mg²⁺ اور Cu²⁺ *Trametes polyzona* WRF03³ کی سرگرمی کو بڑھاتے ہیں۔ Castaño et al.⁴⁸ کو *Xylaria* sp سے وہ کمی ملی۔ تانبے کے آئنوں (Cu²⁺) کے ذریعے کسی حد تک حوصلہ افزائی کی جاتی ہے۔ مزید برآں، Foroutanfar et al.⁴⁴⁹ اور Si et al.⁵⁰ نے بالترتیب *Paraconiothyrium variable* اور *Trametes pubescens* سے laccases پر اسی طرح کے مطالعے کیے ہیں۔ اس انزائم کی قسم II کاپر بائنڈنگ سائٹ (T2) Cu²⁺ کے ساتھ دی گئی ارتکاز میں سیر ہو سکتی ہے، جو زیادہ Cu²⁺³⁹ ارتکاز پر لیکسیس سرگرمی کے محرک کی وضاحت کر سکتی ہے۔ چونکہ سفید روٹ فنگس لکیسیز آکسیڈیز ہیں جن میں ایک سے زیادہ تانبے کے ایٹم ہوتے ہیں، لہٰذا تانبے کے آئنوں کے لیکیس کی سرگرمی پر اثرات متنوع ہوتے ہیں اور محرک اور روکنے والے سے لے کر نیوٹرل تک ہوتے ہیں۔⁵¹ اس کے برعکس، Zhou et al^{. [52]}اطلاع دی کہ^Cu²⁺تائیوان زیر زمین دیمک (اوڈونٹوٹرمس فارموسانس) کی کمی کی سرگرمی کو روکتا ہے۔ تاہم، Cerena sp کے laccases. HYB07^[53]اور Clitocybe maxima^[54]تانبے کے آئنوں سے متاثر نہیں ہوئے تھے۔
سبسٹریٹ کی خصوصیت کو اس کے متحرک پیرامیٹرز (کلومیٹر اور وی میکس) سے ظاہر کیا گیا تھا۔ انزائم سے سبسٹریٹ کا پابند تعلق جتنا مضبوط ہوگا، کلومیٹر کی قدر اتنی ہی کم ہوگی اور سبسٹریٹ کی مخصوصیت اتنی ہی زیادہ ہوگی۔^3,21,55*Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے laccase کے حرکیاتی پیرامیٹرز (Km اور Vmax) کا تعین GraphPad Prism 6.0 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے Lineweaver-Burk پلاٹ (شکل 5) کے ذریعے کیا گیا۔ ABTS کو بطور سبسٹریٹ استعمال کرتے وقت، نتائج 1.99 mM اور 16217 μmol تھے۔^{منٹ⁻¹ L⁻¹،}بالترتیب السید وغیرہ۔²¹نے اطلاع دی ہے کہ ABTS آکسیڈیشن کے لیے کلومیٹر کی قدریں بالترتیب 0.1 mM اور 0.064 mM تھیں، جو ABTS کے لیے Lac A اور Lac B isoenzymes کی اعلی وابستگی کی نشاندہی کرتی ہیں۔ مزید برآں، Vmax قدریں 0.182 μmol تھیں۔^منٹ⁻¹اور 0.603 μmol^منٹ⁻¹بالترتیب حاصل کردہ کلومیٹر کی قیمت Trametes polyzona WRF03 (8.66 mM) سے کم تھی۔ مزید یہ کہ ان کی Vmax قدر (1429 mmol min⁻¹) بھی تھی۔^کمABTS کو بطور ذیلی استعمال کرتے وقت۔ 33 اسی طرح، Lentinus squarrosulus MR13 اور Trametes sp کی کلومیٹر قدر AH28-2 laccase کے ارتکاز بالترتیب 0.0714 mM اور 0.025 mM تھے، اور Vmax قدریں 0.0091 mM min−1 اور 0.67 mM min−1 mg−1 تھیں (ABTS کے نسبت)^{بالترتیب 56,57}
*Pleurotus ostreatus* NRC 620 سے laccase کی سرگرمی پر ABTS کے ارتکاز کے اثر کی چھان بین کی گئی، اور ABTS کے ارتکاز کے مقابلے میں ابتدائی رد عمل کی رفتار کے باہمی تعلق کا ایک Lineweaver-Burk پلاٹ تیار کیا گیا۔ کائنےٹک پیرامیٹرز (Vmax اور Km) کا تعین کرنے کے لیے ABTS کے مختلف ارتکاز (0.025–3.0 mM) laccase کے ساتھ آکسیکرن رد عمل pH 4.5 پر ناپا گیا۔ Michaelis-Menten کائنےٹک کنسٹینٹس کا حساب کیا گیا تھا Lineweaver-Burk پلاٹ کا استعمال کرتے ہوئے رد عمل کی رفتار کے متواتر بمقابلہ سبسٹریٹ ارتکاز۔ گراف پیڈ پرزم 6.01 سافٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے لائن ویور-برک پلاٹ سے حرکی مستقل کا حساب لگایا گیا۔
روایتی واضح کرنے والے انزائمز، جیسے کہ پیکٹینیس، ہائیڈرولائز پیکٹک مادہ، چپکنے والی اور ٹربائڈیٹی کو کم کرتے ہیں۔ وہ ساختی پولی سیکرائڈز کو مؤثر طریقے سے توڑ دیتے ہیں اور پیداوار اور وضاحت کو بہتر بنانے کے لیے اکثر دوسرے انزائمز، جیسے سیلولیز اور ہیمسیلولیسز کے ساتھ مل کر استعمال ہوتے ہیں۔ تاہم، pectinases خاص طور پر phenolic مرکبات کو نشانہ نہیں بناتے ہیں، جو turbidity اور oxidative browning کے لیے اہم کردار ادا کرتے ہیں، خاص طور پر جوس جیسے کہ سیب اور انگور کے رس میں۔⁵⁸اس کے برعکس، laccases فینولک مرکبات کے آکسیکرن کو متحرک کرتے ہیں، انہیں بڑے، ناقابل حل مالیکیولز میں پولیمرائز کرتے ہیں جنہیں تلچھٹ یا فلٹریشن کے ذریعے ہٹایا جا سکتا ہے۔ یہ طریقہ کار نہ صرف وضاحت کو بہتر بناتا ہے بلکہ فینولک مرکبات کی وجہ سے آکسیڈیٹیو براؤننگ کے امکانات کو کم کرکے جوس کی شیلف لائف کو بھی بڑھاتا ہے۔ مزید برآں، laccase پر مبنی وضاحت کے عمل کو ہلکے پروسیسنگ حالات (pH 3.5–5.5، درجہ حرارت 25–40 °C) کے تحت انجام دیا جا سکتا ہے، جو انہیں نازک جوس کے لیے ان کی غذائیت یا آرگنولیپٹک خصوصیات سے سمجھوتہ کیے بغیر موزوں بناتا ہے۔⁵⁹مطالعات سے پتہ چلتا ہے کہ پیکٹینیز کا علاج 1-2 گھنٹے میں رس کو واضح کر سکتا ہے، جبکہ لیکیز کے علاج میں عام طور پر فینولک مرکبات کو مکمل طور پر کم کرنے کے لیے لمبا ردعمل کا وقت (3-6 گھنٹے) درکار ہوتا ہے۔ تاہم، اس عمل کو انزائم کو متحرک کرکے یا میکانکی وضاحت کے طریقوں کے ساتھ لیکیس کو ملا کر بہتر بنایا جاسکتا ہے۔⁶⁰اس مطالعہ میں، خام نچوڑ کے انزائم پروفائلنگ نے اہم laccase اور α-amylase سرگرمیوں کا انکشاف کیا، جبکہ pectinase اور xylanase کی سرگرمیاں انتہائی کم تھیں، اور cellulase کی سرگرمی کا پتہ نہیں چل سکا۔ لہذا، turbidity اور phenolic مواد میں کمی بنیادی طور پر laccase کے عمل کی وجہ سے تھی، جبکہ viscosity میں تبدیلی جزوی طور پر amylase کے عمل کی وجہ سے ہو سکتی ہے۔
جدول 1 تازہ نچوڑے ہوئے سیب کے جوس اور لاکیس سے علاج شدہ نمونوں کے فزیکو کیمیکل پیرامیٹرز کو دکھاتا ہے۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ تازہ نچوڑے ہوئے سیب کے رس کی پیداوار (71.59%) laccase سے علاج کیے گئے نمونوں (87.34%) سے کم تھی۔ یہ نتائج Pilnik اور Orange کے نتائج سے مطابقت رکھتے ہیں۔⁶¹، جنہوں نے اشارہ کیا کہ پھلوں کی پروسیسنگ میں خامروں کا استعمال جوس کی پیداوار کو بڑھا سکتا ہے، فلٹریشن کو بہتر بنا سکتا ہے اور ارتکاز کے لیے اعلیٰ معیار کا صاف رس حاصل کر سکتا ہے۔ رس کی پیداوار میں اضافہ بنیادی طور پر جوس میں حل پذیر شکر کی مقدار میں اضافے کی وجہ سے ہے۔ پھلوں کے انزیمیٹک ہائیڈولیسس کے دوران، مصنوعات کی خلیوں کی دیواروں میں میسوگلیہ اور پیکٹین تباہ ہو کر حل پذیر مادوں جیسے غیر جانبدار شکر اور تیزاب میں تبدیل ہو جاتے ہیں۔⁶²انزائم سے علاج شدہ سیب کے جوس کی pH ویلیو کنٹرول گروپ (P <0.05) کے مقابلے میں نمایاں طور پر کم تھی، اور اسٹوریج کے دوران دونوں گروپوں کی pH قدر میں نمایاں اضافہ ہوا (ٹیبل 1)۔ یہ نتائج مارک ایٹ ال کے نتائج سے مطابقت رکھتے ہیں۔⁶³، جنہوں نے نوٹ کیا کہ گرمی کے علاج کے بعد ذخیرہ کرنے کے بعد کاجو کے پھلوں کے جوس کا پی ایچ کم ہوا۔ انزائم کے علاج کے بعد پیکٹین کا انحطاط اور گیلیکچرونک ایسڈ کی تشکیل سٹوریج کے دوران پی ایچ میں اضافے کے لیے ذمہ دار ہو سکتی ہے۔ انزائم سے علاج شدہ نمونوں کا pH پورے ذخیرہ میں 4.05 اور 4.31 کے درمیان رہا، جب کہ علاج نہ کیے جانے والے سیب کے جوس کا pH 4.12 اور 4.33 کے درمیان رہا۔
علاج نہ کیے جانے والے اور لاکیز سے علاج کیے جانے والے دونوں نمونوں کی کل تیزابیت (TA) نے ذخیرہ کرنے کے وقت میں اضافے کے ساتھ کمی کا رجحان ظاہر کیا (ٹیبل 1)۔ تیزابیت میں کمی کی وجہ نامیاتی تیزاب کے کاربوہائیڈریٹس میں تبدیل ہونے یا انزیمیٹک ری ایکشن کے ساتھ ساتھ جوس ذخیرہ کرنے کے دوران آکسیڈیشن کو قرار دیا گیا۔⁶⁴سیب کے جوس اور انزائم سے علاج شدہ نمونوں کی کل تیزابیت دوسرے جوس سے کم تھی (اسٹرابیری کا جوس 0.9%، بیر کا جوس 2.2%، کمقات کا جوس 1.0%، خوبانی کا جوس 2.4%، اورنج جوس 0.8%)، لیکن دوسرے جوس کی طرح (مثلاً، ناشپاتی کا جوس 0.3%)۔⁶²علاج نہ کیے جانے والے تازہ نچوڑے ہوئے سیب کے جوس میں یہ فرق مختلف عوامل جیسے بڑھتے ہوئے حالات، جینیاتی عوامل، پختگی کی سطح اور پروسیسنگ کے طریقوں کی وجہ سے ہو سکتے ہیں۔⁶⁵کنٹرول کی کل تیزابیت میں کمی اور لاکیس سے علاج شدہ ایپل جوس سنگھ ایٹ ال کے پیش کردہ نتائج کے مطابق ہے۔⁶⁶74 دن کے سٹوریج کے بعد جن نو سیب کے رس کی کل تیزابیت میں کمی کے حوالے سے۔ دوسری طرف، Oshmiansky اور Wojdylo⁶⁷روایتی وضاحتی طریقوں کے اثر کا مطالعہ کرتے وقت سیب کے رس کی تیزابیت میں کوئی خاص تبدیلیاں نہیں پائی گئیں۔
جدول 1 میں پیش کردہ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ لاکیس سے علاج شدہ سیب کے رس کی کل گھلنشیل سالڈز (TSS) کی قیمت غیر علاج شدہ نمونے سے زیادہ تھی۔ یہ نتائج شائع شدہ مطالعات کے مطابق ہیں۔^{. 68}مزید برآں، جدول 1 سے پتہ چلتا ہے کہ کنٹرول ایپل جوس گروپ کی TSS ویلیو ابتدائی ٹائم پوائنٹ پر 9.58 تھی اور اسٹوریج کی مدت کے اختتام تک 11.05 تک پہنچ گئی۔ یہ اقدار تازہ سیب کے جوس کی TSS اقدار سے کم ہیں جو حامد وغیرہ نے رپورٹ کی ہیں۔^{. 69}(بالترتیب 11.2 اور 11.80)۔ لاکیس سے علاج شدہ سیب کے رس کے نمونوں کی TSS قدر میں نمایاں اضافہ ہوا، جو 11.23 سے شروع ہوا اور 4°C (ٹیبل 1) پر دو ہفتوں کے ذخیرہ کرنے کے بعد 12.93 تک پہنچ گیا۔ سٹوریج کے دوران TSS میں اسی طرح کا اضافہ ھٹی پھلوں، لیموں اور میٹھے نارنجی میں بھی دیکھا گیا۔ ذخیرہ کرنے کے دوران کل گھلنشیل سالڈز (TSS) میں اضافہ پولی سیکرائڈز (نشاستہ) سے مونوساکرائڈز (شکر) کے ہائیڈرولیسس، جوس کی پانی کی کمی کی وجہ سے ارتکاز میں اضافہ، اور جوس میں پیکٹین کے حل پذیر ٹھوس میں انحطاط کی وجہ سے ہو سکتا ہے۔ مجموعی طور پر گھلنشیل سالڈز (TSS) میں اضافہ ممکنہ طور پر گھلنشیل شکروں میں اضافے کی وجہ سے ہوتا ہے، جو بالترتیب پیکٹین یا سیلولوز کے ذریعے حل پذیر شکر میں تبدیل ہونے سے یا نشاستے کے ہائیڈولیسس سے شکر میں تبدیل ہو سکتا ہے، جیسا کہ Hamed et al نے رپورٹ کیا ہے۔^69.سیب کے جوس کی خصوصیات پر لیکاس کے اثر کو بصری طور پر دیکھا جا سکتا ہے، کیونکہ لاکیز سے علاج شدہ سیب کا جوس غیر علاج شدہ جوس کے مقابلے میں بہتر بہاؤ اور کم چپکنے کی نمائش کرتا ہے۔ یہ مشاہدہ جدول 1 میں درج ہے۔ انزائم سے علاج شدہ نمونے کی viscosity 1.87 cP تھی، جبکہ کنٹرول کے نمونے کی viscosity 2.95 cP تھی۔ viscosity میں یہ نمایاں کمی ممکنہ طور پر پیکٹین جیسے مادوں کی زیادہ پانی رکھنے کی صلاحیت اور ایک مربوط نیٹ ورک کی ساخت کی تشکیل کی وجہ سے ہے۔
اس تحقیق میں، سیب کے جوس کے براؤننگ انڈیکس (BI) پر لیکسیس کے اثر کی جانچ اسپیکٹرو فوٹومیٹر کے ذریعے 420 nm پر جاذبیت کی پیمائش کرکے کی گئی۔ نتائج جدول 1 میں دکھائے گئے ہیں۔ سٹوریج کے دوران، علاج شدہ اور غیر علاج شدہ دونوں گروپوں میں سیب کے رس کے نمونوں کے BI نے بتدریج بڑھتے ہوئے رجحان کو ظاہر کیا۔ BI براؤننگ کی ڈگری کو ظاہر کرتا ہے اور اس کے طور پر کام کرسکتا ہے۔^{ایک اہم}انزیمیٹک اور غیر انزیمیٹک براؤننگ رد عمل کا اشارہ۔ ذخیرہ کرنے کے دوران جذب میں نمایاں اضافہ ہوا (P <0.05)۔ اسٹوریج کے اختتام پر،_A420کنٹرول اور انزائم سے علاج شدہ گروپس میں سیب کے رس کے نمونوں کی قدر میں بالترتیب تقریباً 217% اور 121% اضافہ ہوا (ٹیبل 1)۔ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ انزائم کا علاج مؤثر طریقے سے براؤننگ ڈگری کو تقریباً 56 فیصد تک کم کر سکتا ہے۔ Bezerra et al کے نتائج۔^[19] ہمارے نتائج سے مطابقت رکھتے ہیں۔ انہوں نے سیب کے رس کو واضح کرنے کے لیے laccase-glutaraldehyde-coconut فائبر کا استعمال کیا، جس سے اس کا اصل رنگ 61 فیصد کم ہو گیا۔
اگرچہ پھلوں کے جوس میں موجود پولی فینول کے انسانی جسم پر مثبت غذائیت اور علاج کے اثرات ہوتے ہیں، لیکن وہ پروٹین کے ساتھ بھی رد عمل ظاہر کر سکتے ہیں، جو رس میں بادل، تلچھٹ یا گندگی کا باعث بنتے ہیں، اس طرح پروڈکٹ کے ذائقے اور مہک کو تبدیل کرتے ہیں اور اس کی شیلف لائف کو کم کرتے ہیں۔⁷¹اس تحقیق کا مقصد Pleurotus ostreatus NRC 620 سے laccase کا استعمال کرتے ہوئے سیب کے جوس کے فینولک مرکب مواد کو محفوظ طریقے سے کم کرنا تھا۔ جدول 1 میں پیش کردہ نتائج سے پتہ چلتا ہے کہ laccase سے علاج شدہ سیب کے جوس کا کل فینولک مرکب مواد 4 °C پر ذخیرہ کرنے سے پہلے نمایاں طور پر کم ہو گیا تھا۔ مزید برآں، مطالعہ کیے گئے دونوں نمونوں (ٹیبل 1) میں اسٹوریج کے دوران کل فینولک مرکب مواد میں بھی کمی واقع ہوئی۔ Sandri et al کی تحقیق۔⁷²ظاہر ہوا کہ انزائم سے علاج شدہ سیب کا رس اپنی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی اور فینولک مرکب مواد کو برقرار رکھ سکتا ہے۔ تاہم، Lettera et al کی طرف سے ایک مطالعہ کے نتائج.⁷³یہ ظاہر کرتے ہیں کہ اورنج جوس کو فنگل لیکس کے ساتھ علاج کرنے سے اس میں موجود فینولک مرکبات کی مقدار 45 فیصد تک کم ہو سکتی ہے۔
فینولک مرکبات میں خصوصیات ہیں جیسے کہ فری ریڈیکل سکیوینگنگ، سنگلٹ آکسیجن میں کمی اور بجھانا، ہائیڈروجن ایٹم کی منتقلی، اور آزاد ریڈیکلز کو الیکٹران کا عطیہ، جو انہیں طاقتور اینٹی آکسیڈنٹس بناتے ہیں۔⁷⁴لہذا، اس مطالعہ میں، ڈی پی پی ایچ اور ایف آر اے پی پر مبنی طریقے استعمال کیے گئے تھے تاکہ 14 دنوں کے لیے ریفریجریٹر میں محفوظ کیے گئے سیب کے جوس کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی پر لاکیس کے اثر کا اندازہ لگایا جاسکے (ٹیبل 2)۔ دونوں طریقوں نے سٹوریج کے دوران اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں اضافہ دکھایا، جس کی وجہ مفت فینولک مرکبات میں اضافہ یا میلارڈ ری ایکشن پروڈکٹس (MRPs) کی تشکیل کی وجہ سے ہو سکتا ہے، میلارڈ ری ایکشن پروڈکٹس ممکنہ طور پر اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں اضافے کی وجہ ہیں۔⁷⁵غیر انزیمیٹک براؤننگ ری ایکشنز (بشمول ascorbic ایسڈ انحطاط، میلارڈ ری ایکشنز، اور شکر کی تیزابی کیٹلیزڈ انحطاط) بھورے رنگ کے روغن (melanoidins) پیدا کرتے ہیں۔ انٹرمیڈیٹ ascorbic ایسڈ انحطاط کی مصنوعات اور شوگر کے انحطاط کی مصنوعات (جیسے کاربونیل مرکبات) میلارڈ ری ایکشن کے ذریعے امینو ایسڈ کے ساتھ رد عمل ظاہر کر سکتی ہیں۔⁷⁶اگرچہ ذخیرہ کرنے کے دوران پھلوں اور سبزیوں کے بھوری ہونے کا بڑے پیمانے پر مطالعہ کیا گیا ہے، لیکن ان ردعمل کے بارے میں ہماری سمجھ محدود ہے۔⁷⁷FRAP طریقہ کے مقابلے میں، laccase-treated apple juice میں DPPH طریقہ (ٹیبل 2) کے ذریعے نمایاں طور پر کم اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی دکھائی گئی، اور ذخیرہ کرنے کے وقت میں اضافے کے ساتھ تمام نمونوں کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی میں نمایاں اضافہ ہوا۔ اس تحقیق میں اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے دو مختلف طریقے استعمال کیے گئے کیونکہ ان کے اصول مختلف ہیں۔ DPPH طریقہ فری ریڈیکلز کو بے اثر کرنے کی صلاحیت کی پیمائش کرتا ہے، جبکہ FRAP طریقہ لوہے کے آئنوں کو کم کرنے کی صلاحیت کی پیمائش کرتا ہے۔ لہذا، مطالعہ شدہ نمونوں کی اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کو بہتر طور پر سمجھنے کے لیے اینٹی آکسیڈینٹ سرگرمی کا تعین کرنے کے لیے متعدد طریقے استعمال کرنے کی سفارش کی جاتی ہے۔⁷⁸
اس تحقیق کے اہم نتائج میں سے ایک یہ ہے کہ *Pleurotus ostreatus* laccase NRC 620 70°C اور pH 3.0 پر بہترین سرگرمی کی نمائش کرتا ہے۔ عام طور پر جوس کی وضاحت کے لیے استعمال ہونے والے دیگر فنگل لکیسیز کے مقابلے، جیسے *Trametes versicolor* اور *Ganoderma lucidum* laccases، *P. ostreatus* NRC 620 اعلی تھرمل استحکام اور زیادہ تیزابی پی ایچ کی نمائش کرتا ہے۔ *Trametes versicolor* اور *Ganoderma lucidum* سے لیکیسس عام طور پر 50-60°C کی حد میں اور 3.5 اور 5.0 کے درمیان pH قدروں میں زیادہ سے زیادہ سرگرمی کی نمائش کرتے ہیں۔ یہ فرق جوس کی وضاحت کی کارکردگی کو بہتر بنانے میں اہم کردار ادا کر سکتا ہے، خاص طور پر تیزابی جوس کے لیے جہاں کم پی ایچ کی قدروں میں استحکام ضروری ہے۔ *P کی منفرد خصوصیت۔ دیگر مطالعہ شدہ فنگل لاکیسس کے مقابلے، *Pleurotus ostreatus* NRC 620 زیادہ مشکل حالات میں مؤثر طریقے سے کام کرنے کی صلاحیت کو ظاہر کرتا ہے۔ اس کا زیادہ سے زیادہ سرگرمی کا درجہ حرارت صنعتی ایپلی کیشنز میں ممکنہ فوائد کی تجویز کرتا ہے، جیسے تیز رد عمل کی شرح اور مائکروبیل آلودگی میں کمی۔ اس کا کم پی ایچ، جو کہ بہت سے جوس کی تیزابیت کے لیے موزوں ہے، جوس کی وضاحت کے عمل میں مفید ہو سکتا ہے۔ یہ نتائج بڑے پیمانے پر استعمال کے لیے مزید تلاش کا جواز پیش کرتے ہیں، جس سے *Pleurotus ostreatus* NRC 620 کو روایتی فنگل لاکیز ذرائع کا ایک قابل عمل متبادل بنایا جاتا ہے۔ پچھلے مطالعات کے مقابلے میں، ہم نے پایا کہ زیادہ سے زیادہ درجہ حرارت 60 ° C ہے اور زیادہ سے زیادہ پی ایچ 3.0 ہے۔ 80 منٹ تک 60 ° C پر ردعمل کے بعد، *Ganoderma lucidum* laccase برقرار رہتا ہے⁴⁶اس کی سرگرمی کا فیصد⁸⁰, *Ganoderma lucidum* انزائمز 25 ° C پر بہترین سے اعتدال پسند استحکام اور 5.0 سے 8.0 تک کے pH قدروں، اور pH 6.0 پر استحکام اور 10 سے 30 ° C کے درجہ حرارت کی نمائش کرتے ہیں۔ اس مطالعہ میں، ہم نے پایا کہ *Pleurotus ostreatus* کے لیے خامروں کی سرگرمی کے لیے زیادہ سے زیادہ پی ایچ اور درجہ حرارت بالترتیب 3.0 اور 70°C تھے۔ دو گھنٹے تک 40 ° C اور 50 ° C پر انکیوبیشن کے بعد، انزائم نے بالترتیب 68.33% اور 59.61% اپنی سرگرمی برقرار رکھی۔ مزید برآں، Pleurotus ostreatus NRC 620 laccase نے 50 ° C سے 80 ° C تک وسیع درجہ حرارت کی حد میں اعلی سرگرمی کی نمائش کی، تقریباً زیادہ سے زیادہ سرگرمی (69%–98%) تک پہنچ گئی، جس میں زیادہ سے زیادہ سرگرمی 70 ° C پر دیکھی گئی۔
آخر میں، oyster مشروم laccase NRC620، جامد حالات میں حاصل کیا گیا، پی ایچ اور درجہ حرارت کے حالات کی ایک حد میں بہترین سرگرمی اور استحکام کا مظاہرہ کیا، دوسرے انزائم ذرائع کے مقابلے میں اعلیٰ استحکام کا مظاہرہ کیا۔ 10 mM MgSO₄ اور CuSO₄ کے اضافے سے انزائم کی سرگرمی میں بالترتیب تقریباً 21% اور 35% اضافہ ہوا۔ جب سیب کے جوس میں پروسس کیا جاتا ہے تو، انزائم نے پی ایچ اور واسکاسیٹی کو کم کیا، جبکہ فینولک مواد کو ذخیرہ کرنے کے دوران صرف تھوڑا سا کم ہوا۔
نتائج کھانے کی صنعت میں، خاص طور پر مشروبات کی وضاحت میں کمی کی صلاحیت کی تصدیق کرتے ہیں۔ خاص طور پر فینولک مرکبات کو توڑ کر، لیکیس نہ صرف گندگی کو کم کرتا ہے اور وضاحت کو بہتر بناتا ہے بلکہ ہلکے آپریٹنگ حالات میں پھلوں کے رس کے معیار کو بھی برقرار رکھتا ہے۔ روایتی واضح کرنے والے ایجنٹوں جیسے کہ جیلیٹن، بینٹونائٹ، اور سیلیکا جیل کے برعکس، لاکیس فضلہ پیدا نہیں کرتا یا مشروبات سے خوشگوار خوشبو نہیں ہٹاتا، جو اسے زیادہ ماحول دوست اور پائیدار آپشن بناتا ہے۔ مزید برآں، دیگر انزائمز اور فلٹریشن کے طریقوں کے مقابلے میں، لیکاس مصنوعات کے معیار پر سمجھوتہ کیے بغیر ایک ہدف اور سرمایہ کاری مؤثر حل پیش کرتا ہے۔
کیوموہیمبو، ایچ ڈی اور برنک، ایچ جی۔ تانبے پر مشتمل لاکیسس کی درخواستیں اور متحرک کرنے کی حکمت عملی؛ ایک جائزہ Heliyon 9, e13156 (2023)۔